ß-Agarase BioChemica, (Lösung in 50 mM Tris · HCl (pH 7,5), 0,1 M NaCl, 0,1% Triton® X-100, 50% Glycerin aus Pseudomonas atlantica, [EC 3.2.1.81]), M= ca. 32700 g/molCAS-Nr.: 37288-57-6, HS-Nr.: 35079090Lagerung: -20°CSpezifikation:DNasen/RNasen/Proteasen.....nicht nachweisbarAktivität.....0,2 bis 1 U/µlPhosphatasen.....nicht nachweisbarHinweis:Die ß-Agarase wurde aus einem E. coli Stamm isoliert, der das klonierte Gen der ß-Agarase I aus Pseudomonas atlantica trägt. Das Enzym verdaut spezifisch das Polysaccharidgerüst der Agarose, bestehend aus 1,3-verknüpften ?-D-Galactopyranose und 1,4-verknüpften 3,6-Anhydro-?-L-Galactopyranose, zu Neoagaro-Oligosacchariden. ß-Agarase aus Pseudomonas atlantica findet bei der Aufreinigung von DNA und RNA aus 'low melt' Agarose Anwendung. Diese Technik ermöglicht besonders die Isolierung großer DNA-Fragmente (> 10kb), da so gut wie keine Scherkräfte auf die DNA wirken, die ansonsten bei allen anderen Isolierungstechniken auftreten. Einheitendefinition: Eine ß-Agarase-Einheit verdaut vollständig 100 ?l (ca. 100 mg) geschmolzener 1 % 'low melt' Agarose in 30 Minuten bei 42°C. Die DNA bzw. RNA lässt sich durch Alkohol-Präzipitation einfach isolieren. ?-Agarase ist im pH-Bereich zwischen 5,0 - 8,5 aktiv, das Optimum liegt bei 6,0. Die optimale Temperatur liegt bei 40 - 42°C. Die Erhöhung der Temperatur auf 45°C beschleunigt zwar die Reaktion, senkt aber die Stabilität. Über 50°C wird das Enzym schnell inaktiviert. Die so erhaltenen Nukleinsäuren können für viele weitere Versuche wie z.B. Restriktionsendonuklease-Verdau, Ligation, Markierung, Sequenzierung, Amplifikation etc. verwendet werden. Um eine Kopräzipitation der Agarose-Oligosacchariden zu vermeiden, sollte die Präzipitation bei Raumtemperatur mit Ammoniumacetat (statt Natriumacetat) ausgeführt werden. Dabei ist allerdings zu beachten, dass Ammonium-Ionen bereits in Konzentrationen über 7 mM die Polynukleotidkinase hemmen. Falls die isolierte DNA phosphoryliert werden soll, muss Natriumacetat verwendet werden.

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