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Art.Nr. APP3830A/0.025
Proteinase K

Proteinase K, (aus Tritirachium album, lyophilisiert), M= 27000 g/molCAS-Nr.: 39450-01-6, HS-Nr.: 35079090, EG-Nr.: 2544578Lagerung: 2 bis 8°C, LGK: 10-13, R: 36/37/38-42, S: 22-24-26-36/37 / WGK: 1, reizend, sensibilisierendEigenschaften:Löslichkeit (20°C).....löslich (H2O)Spezifikation:DNasen/RNasen.....nicht nachweisbarAktivität / mg min. 30 mAnsonUAussehen.....weißpH (1%, H2O, 20°C).....6,2 bis 6,8Hinweis:Proteinase K gehört zur Familie der Subtilisin-ähnlichen Serinproteasen. Sie besitzt endo- und exoproteolytische Aktivität. Aktiviert durch Calcium (1-5 mM) verdaut das Enzym Proteine bevorzugt hinter hydrophoben Aminosäuren (aliphatische, aromatische und andere hydrophobe Aminosäuren). Proteine werden komplett verdaut, wenn die Inkubationszeit lang genug ist und die Protease-Konzentration hoch ist. Werden die Calciumionen entfernt sinkt die Stabilität des Enzyms, auch wenn die proteolytische Aktivität erhalten bleibt. Proteinase K hat zwei Ca2+-Bindungsstellen, die in der Nähe zum aktiven Zentrum lokalisiert sind, aber nicht direkt in den katalytischen Mechanismus involviert sind. Beseitigung der Ca2+-Ionen reduziert die katalytische Aktivität der Proteinase K um 80 %. Die verbleibende Aktivität reicht aus um Proteine abzubauen, die üblicherweise Nukleinsäurepräparationen verunreinigen. Deshalb wird der Verdau mit Proteinase K für die Nukleinsäurereinigung gewöhnlich in Gegenwart von EDTA durchgeführt (Hemmung Magnesium-abhängiger Enzyme). Ist die Anwesenheit von Ca2+ notwendig, wird Ca2+ bis zu 1 mM zugegeben und später mit EGTA beseitigt (pH 8,0, Endkonz. 2 mM). Das pH-Optimum liegt bei 8, das Enzym ist aber in einem weiten pH-Bereich aktiv (pH 4,3 - 12). Eine Erhöhung der Reaktionstemperatur von 37°C auf 50 - 60°C kann die Aktivität mehrfach erhöhen, ebenfalls eine Zugabe von 0,5 - 1 % SDS. Temperaturen über 65°C, Trichloressigsäure oder die Serinprotease-Inhibitoren AEBSF, PMSF oder DFP hemmen die Aktivität. Proteinase K wird nicht durch EDTA (siehe Ref. 2), Harnstoff (1 - 4 M), SDS, Citrat, Iodessigsäure oder, interessanter Weise, durch andere Serinprotease-Inhibitoren wie TLCK und TPCK gehemmt. Muss Proteinase K inaktiviert werden, ist darauf zu achten, dass die Temperatur nicht unter 95°C liegt und die Dauer nicht 10 Minuten unterschreitet. Auch eine TCA-Fällung ist geeignet. Proteinase K wird für den Abbau von Proteinen in Zelllysaten (Gewebe, Zellkulturzellen) und zur Freisetzung von Nukleinsäuren verwendet, da sie auch sehr effektiv DNasen und RNasen inaktiviert. Hier einige Anwendungsbeispiele: Herstellung genomischer DNA aus Bakterien (Miniprep): Bakterien aus einer gesättigten Flüssigkultur werden lysiert und Proteine durch Verdau mit 100 ?g/ml Proteinase K für 1 h bei 37°C entfernt (Ref. 1 Suppl. 40 Seite 2.4.1), Whole-Mount in situ hybridization und Nachweis von RNAs in Vertebratenembryos und isolierten Organen: Verdau der Probe z. B. in 10 ?g/ml Proteinase K für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Die Dauer der Behandlung und/oder die Konzentration des Enzyms muss optimiert werden (Ref. 1 Suppl. 35 Seite 14.9.3), Herstellung von DNA aus Zellen oder Gewebe für die PCR: Zellen oder Gewebe werden über Nacht bei 50°C mit 100 ?g/ml Proteinase K inkubiert (Ref. 1 Suppl. 17 Seite 15.3.1), Isolierung von Vaccinia-Virus DNA: Verdau des Virus in einer Suspension mit 2 mg/ml Proteinase K für 4 h bei 37°C (Ref. 1 Suppl. 43 Seite 16.17.8), Vor der Phenolextraktion zur Reinigung von Nukleinsäuren kann ein Proteinase K-Verdau eingeführt werden (50 - 200 ?g/ml Endkonzentration, 37°C für 30 Minuten in Gegenwart von SDS, Ref. 4). Die von uns empfohlene Arbeitskonzentration liegt bei 10 - 100 ?g/ml. Stabilität: Proteinase K ist bei +4°C im lyophilisierten Zustand mindestens 12 Monate stabil. In Lösung beträgt die Stabilität bei +4°C bis -20°C ca. 6 - 12 Monate. Als Lösungsmittel für Stammlösungen (10 - 20 mg/ml) sind zum Beispiel 10 mM CaCl2 oder 50 mM Tris · HCl, pH 8,0, 1 mM CaCl2 oder 50 % Glycerin, 20 mM Tris · HCl, pH 7,4, 1 mM CaCl2 oder 50 % Glycerin, 50 mM Tris · HCl, pH 8,0, 1 mM CaCl2 geeignet.

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Proteinase K
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Maße   Preis   Art.Nr.
25 mg 37.60 EUR APP3830A/0.025
100 mg 83.80 EUR APP3830A/0.100
500 mg 250.70 EUR APP3830A/0.500

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