- RNase Inhibitor ist ein rekombinantes menschliches Plazentaprotein, das Ribonukleasen (RNasen) A, B und C hemmt. Es hemmt nicht RNase 1, RNase H, RNase T1, S1 Nuclease oder RNAse von Aspergillus. Der native RNase-Inhibitor aus der menschlichen Plazenta übt seine inhibitorische Wirkung aus, indem er nichtkovalent an RNasen im Verhältnis 1: 1 mit einer Assoziationskonstante von 1014 bindet
- Es gibt keine Hemmung der Polymeraseaktivität, wenn dieser RNase-Inhibitor mit AMV-Reverse-Transkriptase, M-MuLV-Reverse-Transkriptase, Taq-DNA-Polymerase oder Phagen-RNA-Polymerase (SP6, T7 oder T3) verwendet wird.
- Das Enzym ist über einen breiten pH-Bereich zwischen 5 und 8 aktiv, mit einer maximalen Aktivität bei pH 7 - pH 8
- Konzentration: 20 Einheiten / µL bis 40 Einheiten / µL (Details siehe Produktetikett)
- >Einheitendefinition: Eine Einheit ist definiert als die Menge an Rnase-Inhibitor, um 5 ng RNase A bei 25 ° C um 50% zu hemmen, wobei Cytidin-2'-, 3'-cyclisches Monophosphat (cCMP) als Substrat verwendet wird
- Testbedingungen: 20 mM Tris / HCl (pH 8,0 bei 25 ° C), 2 mM MnCl 2, 100 mM KCl, 1 mM DTT, 0,6 mM Poly (rA), 0,1 mM Poly (dT) 10–20, 0,5 mM dTTP (3H) ,0,5-5 Einheiten Enzym
Hinweise:
- Für den Ribonuklease-Inhibitor muss mindestens 1 mM DTT aktiv sein
- Vermeiden Sie Temperaturen über 50 ° C und hohe Konzentrationen an Harnstoff oder anderen Denaturierungsmitteln
- Wir empfehlen die Verwendung von 1 Einheit pro Reaktionseinheit
- Qualitätskontrolle: Endonuklease: Enthält keine nachweisbare Endonukleaseaktivität. Die Inkubation von 200 Einheiten des Enzyms mit supergewickeltem Plasmid ergab nach einer 2-stündigen Inkubation bei 37 ° C, wie durch Ethidium-gefärbte DNA bestimmt, keine gekerbten Moleküle. Ribonuklease: Es wird keine Ribonukleaseaktivität beobachtet, nachdem 1 Mykrogramm g RNA mit 200 Einheiten des Enzyms 60 Minuten lang bei 37 ° C inkubiert wurde.Die RNA wird auf einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt. Nach 1 µg RNA wird keine latente Ribonukleaseaktivität beobachtet 60 Minuten bei 37 ° C mit 200 Einheiten vorgewärmtem Enzym inkubiert. Die RNA wird auf einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und mit Ethidiumbromid gefärbt.
- DNase: 50 ng radioaktiv markierte DNA werden mit 200 Einheiten Enzym 60 Minuten lang bei 37 ° C inkubiert und radioaktiv markiert. Die Nukleotide werden durch Szintillationszählung von TCA-löslichem Material überwacht. Die Mindestspezifikation beträgt <3% Freisetzung der eingegebenen Radioaktivität in TCA-lösliches Material
- Speicherpuffer: 20 mM Hepes / KOH (pH 7,6), 50 mM KCl, 8 mM DTT, 50% Glycerin
- Lagerung: Eine Lagerung bei –20 ° C wird empfohlen.
Anwendung:
- Jede Anwendung, bei der eine eukaryontische RNase-Kontamination ein potenzielles Problem darstellt
- Schutz der mRNA in cDNA-Synthesereaktionen
- In-vitro-Transkription / Translation
- Verbesserung des In-vitro-Virusnachweises
- Verbesserung der RNA-Translation in homologen Systemen
- Präparationen von RNase-freien Antikörpern
Referenz: Blackburn, P. (1979), J. Biol. Chem. 254, 12484
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